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苯乙醇胺A檢測(尿液、組織、飼料)結(jié)果判斷
點(diǎn)擊次數(shù):1117 更新時(shí)間:2022-07-20

EF44A\J2

苯乙醇胺A

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物苯乙醇胺A將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗苯乙醇胺A抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物苯乙醇胺A的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物苯乙醇胺A的含量。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度:   0.1ppb

孵育溫度:       25℃

孵育時(shí)間:       30min15min

樣本檢測下限

尿             ·····························  0.1ppb

             ·····························  0.2ppb

             ·····························  0.5ppb

交叉反應(yīng)率

苯乙醇胺A  ······································ 100%

克倫特羅(Clenbuterol························ <1%

沙丁胺醇(Salbutamol ·····················  <1%

萊克多巴胺(Ractopamine···················  <1%

樣本回收率

尿         ······························  95%±25%

組織、飼料   ······························  85%±25%

三、試劑盒組成

1

微量測試孔

每條8孔,一板12

2

標(biāo)準(zhǔn)液×6

1ml/瓶)

0ppb

0.1ppb

0.3ppb

0.9ppb

2.7ppb

8.1ppb

3

酶標(biāo)記物

7ml

紅色帽

4

抗體工作液

10ml

藍(lán)色帽

5

底物A

7ml

白色帽

6

底物B

7ml

黑色帽

7

終止液

7ml

黃色帽

8

20X濃縮洗滌液

40ml

白色帽

9

2X濃縮復(fù)溶液

50ml

透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)

微量移液器:單道 20200µl、單道1001000µl、多道 30300 µl

使用的試劑:乙酸乙酯、冰乙酸、正己烷

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

a)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

樣本前處理需配置

配液1   樣本提取液

99ml乙酸乙酯,加入1ml冰乙酸,混合均勻。

配液2   樣本復(fù)溶液:

2X濃縮復(fù)溶液用去離子水12稀釋。

樣本處理:

a尿樣本處理方法

20µl清亮尿樣直接測定(如果尿樣渾濁一定要過濾或4000r/min離心10min,直至得到清亮尿樣),暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

樣本稀釋倍數(shù):  1

因樣本存在一定干擾,建議以1ppb為樣本陽性 的CUT OFF值。  

b組織樣本處理方法

1、 稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g50ml離心管中;

2、 加入8ml樣本提取液,渦旋震蕩2min;

3、 室溫4000r/min離心10min

4、 取上層清液2ml50-60℃吹干;

5、 加入1ml正己烷,再加入1ml樣本復(fù)溶液,渦旋震蕩30秒;

6、 室溫4000r/min離心10min;除去上層有機(jī)相;

7、 取下層清液20µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  2

    因樣本存在一定干擾,建議以1ppb為樣本陽性的CUT OFF值。

 c飼料樣本處理方法

1、 稱取均質(zhì)后的飼料樣本1±0.05g50ml離心管中;

2、 加入10ml樣本提取液,渦旋震蕩3min;

3、 室溫4000r/min離心10min

4、 取上層清液2ml50-60℃吹干;

5、 加入1ml正己烷,再加入1ml樣本復(fù)溶液,渦旋震蕩30秒;

6、 室溫4000r/min離心10min;除去上層有機(jī)相;

7、 取下層清液20µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  5

因樣本存在一定干擾,建議以2ppb為樣本陽性的CUT OFF值。本試劑盒檢測牛尿時(shí)回收率偏高。   

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

測定前應(yīng)須知:

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(2025℃)。

2、 使用之后立即將所有試劑放回28℃。

3、 ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。

4、 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟:

1、 28℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(2025)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 配液:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照119稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。

3、 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于28℃。

4、 編號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20µl/到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/,再加入80µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜蓋板,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

6、 將孔內(nèi)液體甩干,用稀釋好的洗滌液250µl/孔洗板45次,每次間隔1530秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

7、 顯色:加入底物A50µl/孔,再加入底物B50µl/孔,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、 測定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內(nèi)讀數(shù)),測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含苯乙醇胺A量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定:

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb2.143; 0.1ppb1.866;0.3ppb1.615;0.9ppb0.964;2.7ppb0.413;8.1ppb0.155。則樣本1的濃度范圍是0.3ppb0.9ppb;樣本2的濃度范圍是2.7ppb8.1ppb,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中苯乙醇胺A實(shí)際濃度。

2、定量分析

1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即

百分吸光%)=

B

×100%

B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品濃ng/ml)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中苯乙醇胺A實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索取)

八、 注意事項(xiàng)

1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫(2025℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻,否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

1、 儲(chǔ)藏條件:試劑盒于2-8℃保存,不要冷凍。

2、  質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,請(qǐng)放心使用。

2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色,是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!

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