四環(huán)素快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物四環(huán)素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗四環(huán)素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物四環(huán)素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物四環(huán)素的含量。
二、試劑盒特性
- 試劑盒靈敏度： 0.05ppb
u | 孵育溫度： | 25℃ |
u | 孵育時間： | 30min～15min |
| 樣本檢測下限 |
雞肉樣本： |
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四環(huán)素 ··········································· | 0.4ppb |
二甲按胺四環(huán)素 ·································· | 0.4ppb |
吡四環(huán)素 ········································ | 0.4ppb |
金霉素 ········································ | 0.4ppb |
脫甲基金霉素 ································· | 1.2ppb |
土霉素 ·········································· | 0.8ppb |
強力霉素 ······································· | 1ppb |
豬肉、蜂蜜樣本： |
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四環(huán)素 ·········································· | 0.5ppb |
二甲按胺四環(huán)素 ································· | 0.5ppb |
吡四環(huán)素 ······································ | 0.5ppb |
金霉素 ········································· | 0.5ppb |
脫甲基金霉素 ································ | 1.5ppb |
土霉素 ··········································· | 1ppb |
強力霉素 ········································ | 1.2ppb |
- 交叉反應(yīng)率
四環(huán)素 ·········································· 100%
二甲按胺四環(huán)素 ································· 125%
吡四環(huán)素 ······································· | 110% |
金霉素 ··········································· | 100% |
脫甲基金霉素 ··································· | 35% |
土霉素 ············································ | 58% |
強力霉素 ········································· | 45% |
- 樣本回收率
雞肉、豬肉、蜂蜜 ···························· 85±20%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條 8 孔，一板 12 條 | |
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2 | 標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液 | 1ml | 黑色帽 |
（81ppb） | |||
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3 | 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品 | 1ml | 黑色帽 |
（100ppb） | |||
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4 | 酶標(biāo)記物 | 7ml | 白色帽 |
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5 | 抗體工作液 | 7ml | 白色帽 |
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6 | 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 |
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7 | 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
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8 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
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9 | 20X 濃縮洗滌液 | 15ml | 白色帽 |
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10 | 10X 樣本提取液 | 50ml*2 | 透明帽 |
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11 | 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液 | 15ml*2 | 藍(lán)色帽 |
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四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：甲醇
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，
必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實 | 3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 | ||||||
驗結(jié)果。 | 洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 | ||||||
u | 樣本前處理需配制： | 程序中的要點。 |
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配液 1 | 樣本提取液 A | 4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜 | |||||
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| 用去離子水450ml 與50ml 10X 樣本提取液 | 蓋住微孔板。 |
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| 混勻或按 9：1 的比例按需配制（如 10X | u 操作步驟： |
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| 樣本提取液有結(jié)晶，需溶解后在進行稀 | 1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～ | ||||
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| 釋）。 | 25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使 | ||||
配液 2 | 樣本提取液 B | 用前均須搖勻。 |
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| 取甲醇 50ml 與 450ml 樣本提取液 A 混勻 | 2、配制標(biāo)準(zhǔn)品 |
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| 或按 1：9 的比例按需配制。 | 標(biāo)準(zhǔn)品 6：50µl 標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液（81ppb）用 950µl | ||||
配液 3 | 樣本提取液 C | 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液稀釋 | 4.05ppb | ||||
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| 取甲醇 100ml 與 270ml 樣本提取液 A 混勻 | 標(biāo)準(zhǔn)品 5：600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 6 | ||||
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| 或按 10：27 的比例按需配制。 | 混合 | 1.35ppb | |||
u | 樣本處理： | 標(biāo)準(zhǔn)品 4：600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 5 | |||||
（a）雞肉處理方法 | 混合 | 0.45ppb | |||||
1、稱取 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中， | 標(biāo)準(zhǔn)品 3：600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 4 | ||||||
| 加入 8ml 樣本提取液 A（見配液 1），振蕩 3min， | 混合 | 0.15ppb | ||||
| 室溫 4000r/min 以上，離心 10min； | 標(biāo)準(zhǔn)品 2：600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 3 | |||||
2、取 50 上清液用于分析 | 混合 | 0.05ppb | |||||
| 樣本稀釋倍數(shù): 8 倍 | 標(biāo)準(zhǔn)品 1：標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液 | 0ppb | ||||
（b）豬肉處理方法 | 3、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放 | ||||||
1、稱取 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中， | 入自封袋，保存于 2-8℃。 |
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| 加入 10ml 樣本提取液 B（見配液 2），振蕩 3min， | 4、配液：將 15ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去 | |||||
| 室溫 4000r/min 以上，離心 10min； | 離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份 | |||||
2、取 50 µl 上清液用于分析 | 去離子水），或按所需用量配制洗滌液。 | ||||||
| 樣本稀釋倍數(shù): 10 倍 | 5、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每 | |||||
（c）蜂蜜處理方法 | 個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和 | ||||||
1、 稱取 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中， | 樣本孔所在的位置。 |
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| 加入10ml 樣本提取液C（見配液3），振蕩3min， | 6、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加 | |||||
| 室溫 4000r/min 以上，離心 10min； | 加入酶標(biāo)記物 50µl/孔再加入抗體工作液 50µl/ | |||||
2、 取 50 µl 上清液用于分析 | 孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境 | ||||||
| 樣本稀釋倍數(shù): 10 倍 | 中反應(yīng) 30min。 |
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| 7、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔 | ||||||
六、酶標(biāo)免疫分析程序: | |||||||
洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙 | |||||||
u | 測定前應(yīng)須知： | ||||||
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| 1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 | 拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺 |
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| （20～25℃）。 | 破）。 |
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| 8、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B |
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| 2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。 |
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| 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯 |
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色 15min。
9、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含四環(huán)素量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：
0ppb 為 2.243；0.05ppb 為 1.816；0.15ppb 為 1.415； 0.45ppb 為 0.74；1.35ppb 為 0.313；4.05ppb 為 0.155。
則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2
的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第--個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以 100%，即
B
百分吸光率（%）＝ ×100%
B0
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)
品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。
八、 注意事項
1、室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、該試劑盒理想反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。
2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
